□ 카탑(Cartap), 티오사이클람(Thiocyclam) 시험법

가. 시험법 적용범위

닭고기 및 알에 적용한다.

나. 분석원리

검체 중 카탑, 티오사이클람을 2% 시스테인 염산용액, 3% 염화니켈 용액 및 암모니아수를 사용하여 네레이스톡신(nereistoxin)으로 전환시켜 헥산 및 아세토니트릴로 추출한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 옥살산수소 네레이스톡신(nereistoxin hydrogen oxalate) 표준품을 아세토니트릴에 녹여 네레이스톡신(nereistoxin)으로써 100 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 무처리시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

5) 2% 시스테인(cysteine) 용액: 무수염산시스테인(L-cysteine-HCl, anhydrous) 20 g을 0.02 N 염산 용액 950 mL에 녹인 후 10 N 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 3로 맞춘 다음 0.02 N 염산용액을 첨가하여 1,000 mL가 되게 한다.

6) 3% 염화니켈(nickel chloride) 용액: 염화니켈 3 g을 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

7) 기타시약: 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출

균질화한 시료 10 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하여 2% 시스테인 용액 40 mL(우유와 계란의 경우 30 mL)를 가하고  30분간 진탕 추출한다(단, 추출액의 pH가 4∼5 범위를 벗어날 경우, 2 N 염산용액으로 조절한 후 30분간 다시 진탕 추출한다). 이를 4,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액 20 mL를 별도의 50 mL 원심분리관에 취한다(계란의 경우 상층액을 별도의 50 mL 원심분리관에 옮긴 후 추출용액으로 전체 부피를 40 mL로 한 다음 그 중 20 mL를 취한다). 여기에 3% 염화니켈 용액과 진한 암모니아수를 각각 1.5 mL씩 첨가한 다음 5분간 진탕한 후 70℃ 수욕상에서 1시간 동안 진탕 반응 시킨다. 반응이 끝난 추출액을 냉각시킨 다음 10 N 황산 용액을 첨가하면서 pH 5로 맞춘 후 헥산 10 mL를 가하여 진탕한다. 이를 4,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버린 다음 10 N 수산화나트륨 용액을 첨가하면서 pH 9로 맞춘다. 여기에 염화나트륨 6 g과 아세토니트릴 20 mL을 가한 후 진탕하고, 다시 4,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 다음 상층액(아세토니트릴 층)을 멤브레인 필터(PTFE, 0.45 μm)로 여과한 후 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 칼럼: HILIC(Waters XBridge, 2.1 mm i.d. × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 칼럼 온도: 40℃

다) 이동상: 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴/0.1% 포름산 함유 물(90/10, v/v)

라) 이동상 유속: 0.4 mL/분

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode

나) Capillary voltage: 4.0 kV

다) Collision gas: 아르곤(Ar)

라) Cone voltage: 12 V

표. 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	평균 분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, [M+H]+, m/z))	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
네레이스톡신 (Nereistoxin)	149.0	149.03	150	105	12
				71	36

1) 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며, 그 외는 정성이온임

※ 각 생성이온에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함.

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품의 크로마토그램

그림. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램

네레이스톡신: 1.6분

5) 정량한계

0.005 mg/kg

사. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 네레이스톡신을 확인한다.