□ 스피노사드(Spinosad) 시험법

가. 시험법 적용범위

닭고기 및 알에 적용한다.

나. 분석원리

검체 중 스피노사드를 아세토니트릴로 추출하고, 황산마그네슘, 아세트산나트륨을 가하여 원심분리한 상층액을 취해 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 스피노신 A 및 스피노신 D 표준품을 각각 아세토니트릴에 녹여 100 mg/L가 되게 하여 갈색병에 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 아세토니트릴로 적당한 농도로 희석한다.

5) 기타시약: 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출

균질화한 검체 5 g(알은 10 g)을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하여 아세토니트릴 20 mL(알은 10 mL)를 가한 뒤 1분간 균질화 한 후, 황산마그네슘 6 g과 아세트산나트륨 1.5 g을 차례로 가하고 1분간 진탕한다. 진탕 후 추출물을 4,000 rpm으로 5분간 원심분리 한다. 상층액 1.5 mL을 2.0 mL 원심분리관에 옮긴 후 다중벽 탄소나노튜브(multi-wall carbon nano tubes) 6 mg과 황산마그네슘 225 mg을 가하고 10초간 진탕한 후 4,000 rpm으로 5분간 원심분리한다. 상층액 1 mL에 아세토니트릴 1.5 mL를 가하여 혼합하고(알의 경우 상층액 1mL만 취함) 멤브레인필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과한 후 갈색 바이알에 옮겨 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 칼럼: C18(Agilent Eclipse Plus, 3.0 mm i.d. × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 칼럼 온도: 30℃

다) 이동상

(1) 이동상 A: 아세토니트릴

(2) 이동상 B: 0.1% 포름산 함유 물

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	10	90
4.0	100	0
5.0	100	0
7.0	10	90
10.0	10	90

라) 이동상 유속: 0.3 mL/분

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI positive-ion mode

나) Capillary Voltage: 3.5 kV

다) Collision gas: 아르곤(Ar)

라) Cone voltage: 42 V

표. 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	평균 분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, [M+H]+, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
스피노신 A (Spinosyn A)	732.0	731.46	732	142	46
				98	60
스피노신 D (Spinosyn D)	746.0	745.47	746	142	42
				189	50

1) 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며, 그 외는 정성이온임

※ 각 생성이온에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함.

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품의 크로마토그램

그림. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램

스피노신 A(A: 4.95분), 스피노신 D(B: 5.01분)

5) 정량한계

가) 0.001 mg/kg(알)

나) 0.01 mg/kg(닭고기)

사. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 스피노신 A와 스피노신 D를 확인한다.